Día 22 - Termina la supervivencia, recontamos enterococos fecales en Slanetz-Barley

Recuento enterococos fecales por filtración

 

Sesión 12                   Práctica 14

Y vamos ya con la última práctica que hemos realizado este año, ha si muy interesante aprender tantas cosas en laboratorio, el pequeño Dexter que tengo en mi interior está orgulloso de haber aprendido a hacer tantas cosas, y para terminar no podía ser de otra manera ¡Recuento! Vamos a recontar enterococos fecales por lo que necesitaremos un medio Slanetz-Barley para ello y 44ºC, pero no adelanto más cosas  ¡A por la bata!

Objetivos

Recontar enterococos fecales en el medio agar Slanetz-Bartley

Hacer la siembra mediante filtración con kitasato 100ml. 50 muestra/50 agua estéril

Interpretar resultados obtenidos

Fundamento

 

Slanetz-Barley

Medio muy selectivo indicado para aislamiento y recuento de enterococos fecales en agua y en alimentos, con la técnica de filtración de membrana o con el método de siembra en superficie. No crece E. Coli

Incubación: Incubar a 36 ºC aproximadamente, 44 horas (para mejor selectividad, a 44-45 ºC aproximadamente, preferiblemente tras 4h a 36°C aproximadamente). Contar todas las colonias rojo, marrón o rosa como enterococos presuntiva. No todas las especies reducen TTC colonias, por lo tanto pálidos no deben ser ignorados.

Composición:

-Triptona y Extracto de levadura (Nutrientes energéticos para crecimiento MO)

-Glucosa (Hidratos de carbono para bacterias fermentadoras)

-Fosfato dipotásico (Fostatos para bacterias)

-Azida sódica (Inhibidora de Gram-)

TTC

Agar (Solidificante del medio)

Útil para:

E.coli MKTA 25922                                        Inhibido.

Bacillus subtilisMKTA 6633                              Inhibido.

Enterococcus duransMKTA 10541             Bueno, Colonias rosas-granates, pequeñas.

Enterococcus faecalis MKTA 29212           Bueno, Colonias rosas-granates, pequeñas.

  Enterococcus faecalis

Materiales

Mechero

Vasos de precipitado (agua destilada estéril, agua muestra, alcohol)

Embudo

Probeta 100 ml

Pipeta Pasteur

Matraz Kitasato

Alcohol

Agua Destilada Estéril

Placa Petri estéril

Pinzas

Mechero Bunsen

Filtro reticulado

Placa Petri con cultivo Slanetz-Bartley

Procedimiento

1. Preparamos el lugar de trabajo montando el matraz kitasato con sus partes y el aparato de vacío. También encendemos el mechero bunsen ya que necesitamos condiciones de esterilidad

2. Teniendo el agua muestra ya preparada, preparamos en un vaso de precipitado alcohol para cuando tengamos que flamear las pinzas y en la placa Petri estéril ponemos agua destilada estéril para dejar el filtro que vamos a usar y que se despegue la parte sobrante

3. Para coger el filtro flameamos primero las pinzas con cuidado, cogemos le filtro y lo pasamos a la placa Petri con el agua estéril. Seguidamente cerramos la placa Petri hasta que se despegue bien el trozo sobrante del filtro.

4. Volvemos a esterilizar las pinzas y cogemos el filtro

5. De forma rápida pero eficaz vamos a poner el filtro encima del Kitasato y cerramos con el embudo para filtrar, ponemos las pinzas de seguridad para que no se vaya a caer el embudo  y hacer mejor la filtración.

6. Encendemos la bomba de vacío, el agua irá pasando por el filtro, en este paso asegurarnos que todo el aparato de filtrado está bien apretado sino la aspiración será escasa y tardará más

 

7. Al terminar retirar pinzas de sujeción, embudo y coger el filtro con las pinzas (previamente esterilizadas flameándolas)   

8. Se deja el filtro en la placa Petri del medio agar Slanetz-Bartley con cuidado de no hacer burbujas entre el medio y el filtro

9. Rotular la placa con los datos necesarios sobre el recuento que se está realizando, fecha y persona.

10. Por último guardar el cultivo boca abajo y a una temperatura de 44ºC durante 18-24 horas

Medidas de prevención

Cuidado al flamear con que caiga algo del alcohol sobre el papel filtrante sobre el que trabajamos

Cuando se manipule la muestra usar guantes para evitar contagios, pero cuando se está con el fuego se debe quitar el guante con el que se está manipulando ya que entorpece y puede llevar a errores

Resultados

Salieron menos de 30 colonias por lo que serían incontables (Salieron 8 colonias)

Día 21 - Agua peptonada, siembra y medición de su turbidez

Siembra de agua peptonada y su lectura de turbidez

 

Sesión 11                  Práctica 13

Practica sencilla, solo tenemos que sembrar agua peptonada para poder después con el crecimiento de microorganismos medir su absorbancia y poder hallar su UFC ¡A por la bata!

Objetivos

Siembra de agua peptonada

Recuento de UFC mediante su absorbancia y escala de MacFarland

Fundamento

Agua peptonada

Medio de enriquecimiento no selectivo, recomendado para ser utilizado en lugar de solución fisiológica para recuperar células de enterobacterias dañadas por procesos fisicoquímicos

Composición:

-Peptona de carne (Nutrientes para las bacterias)

-Cloruro sódico (Se usa para la resistencia o tolerancia salina de la bacterias y mantener el balance osmótico)

Incubación: Aeróbica, a 35-37 ºC durante 18-24 horas.

Se suele usar contando con un control negativo sin inocular bacterias como referencia.

Color: ámbar claro

Útil para:

Escherichia coli ATCC 25922           Bueno

Staphylococcus aureus ATCC 25923  Bueno

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853       Bueno

Materiales

Tubos con agua peptonada (Según queramos sembrar)

Tubo con agua muestra

Asa de siembra

Mechero bunsen

Vasos de precipitado

 Agua destilada

 Mechero

Gradilla

Procedimiento

1. Montamos el lugar de trabajo en condiciones de esterilidad para poder comenzar con la siembra.

2. Cogemos el tubo que vayamos a sembrar con la mano no dominante. Con la mano dominante cogemos el asa de siembra, esterilizamos la punta hasta llevar a rojo vivo

 

3. El tubo con agua peptonada lo abrimos, esterilizamos la boquilla y dejamos el tapón agarrado con el dedo meñique de la mano no dominante, cogemos con el asa de siembra del agua de muestra (o cultivos anteriores que queramos coger el inóculo) y lo introducimos en el agua peptonada

4. Movemos el asa de siembra en el interior para que se desprenda el inóculo

5. Sacamos el asa de siembra, volvemos a esterilizar y la dejamos, volvemos a esterilizar la boquilla del tubo de agua peptonada, cerramos y dejamos rotulando siempre de que se trata, cuándo se ha hecho y quién lo ha hecho.

6. Repetimos mismo proceso con todos los tubos de agua peptonada que queramos sembrar y metemos en gradilla al final en la estufa a 37ºC 24 horas

7. Al día siguiente el agua presentará turbidez, cogemos un tubo de agua peptonada sin sembrar para contraste y lo metemos al espectrofotómetro a 550nm y en la celda del blanco (antes habremos calibrado el espectrofotómetro)

8. Teniendo el blanco de agua peptonada echa, metemos el tubo de agua peptonada sembrado y apuntamos su absorbancia

9. Teniendo la absorbancia del tubo de agua peptonada sembrada, solo tenemos que coger ese dato y cambiarlo por la Y en la anterior recta de calibrado que hemos realizado. Sabiendo la absorbancia, la a y la b podemos hallar perfectamente la X que en este caso será la UFC

Medidas de prevención

Cuando estamos con elementos de turbidez siempre agitar o remover el medio que se va a medir o trabajar, ya que en estos casos la concentración es muy importante que sea igual en todos los sitios para evitar errores

Cálculos

La abosrbancia del tubo muestra es de 0,640 por lo que el cáculo que debemos hacer es de:

0,660= 0,0461 + 0,069X

Despejamos la x y nos da à 8,89·10(elevado a 8)

Resultados

El resultado es de 8,89·10(elevado a 8) UFC/ml

Día 20 - Nos enfrentamos a MacFarland, recta de calibrado

Medición absorbancia Escala de MacFarland

 

Sesión 10                   Práctica 12

Recordáis cuando hicimos la escala de MacFarland, hace ya bastantes post hicimos solo los tubos para dejarlos preparados, pues ahora vamos a hacer lo que es la medición de estos tubos, porque como dije, vamos a hacer con las absorbancias que obtengamos en el espectrofotómetro una nueva recta de calibrado ¡A por la bata!

Objetivos

Medir la absorbancia de los tubos de MacFarland que elijamos para que nos salga significativa

Realizar la recta de calibrado

Fundamento

Como referencia en suspensiones bacteriológicas para saber que el número de bacterias por mililitro, o más bien en UFC según una escala que va de 0.5 a 10. Estos estándares son creados al mezclar soluciones de cloruro de bario al 1% con ácido sulfúrico al 1% en volúmenes específicos, para asegurar la densidad correcta se puede controlar usando espectrofotómetros.

Los estándares pueden ser visualmente comparados con suspensiones de bacterias en salina estéril o en caldos. Si la suspensión es demasiado turbia, puede añadirse diluyente, y si no es lo suficiente turbia, se puede agregar más bacterias. La ventaja es que no es necesario incubar ni usar equipo especial para estimar el número de bacterias

La espectrofotometría es uno de los métodos de análisis más usados, y se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.

Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a medir, la muestra puede estar en fase líquida, sólida o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagnético, la muestra es generalmente disuelta para formar una solución.

 Cada sustancia tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que muestra la cantidad de energía radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a una determinada longitud de onda de la energía radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto.

Materiales

Regla

Calculadora

Tubos de MacFarland (Anteriormente realizados)

Material para escribir

Agua destilada estéril

Aparato

Espectrofotómetro (Con sus cubetas)

Procedimiento

1. Montamos el lugar de trabajo donde el espectrofotómetro, comenzaremos encendiéndolo ya que primero se tiene que calibrar y eso le lleva algo de tiempo, mientras preparamos el resto de material

2. Una vez calibrado ponemos la absorbancia en 550nm y dejamos puesta la celda del “blanco” en el espectrofotómetro ya que será ahí donde hagamos todas las mediciones

3. Introducimos primero el tubo “blanco” con agua destilada estéril, con el que vamos a tarar en autocero, así el resto de tubos que introduzcamos serán con absorbancias correctas

4. De los tubos de la Escala de MacFarland elegimos cuales queremos que sean los representativos para hacer nuestra recta de calibrado, en nuestro caso tubos: 0(Blanco), 0.5, 3, 5 y 6

5. Al saber la absorbancia de cada uno de los tubos ya sabemos la (Y) de nuestra recta de regresión, y el UFC ya lo sabíamos de cada tubo que es la (X) por lo que podemos comenzar con nuestra recta de calibrado haciendo la primera tabla:

6. Realizamos el coeficiente de regresión para ver si la pendiente de la recta es fiable:

7. Y por último podemos realizar ya la recta de calibrado, en nuestro caso en cálculos solo, pero que es suficiente para después hallar los datos que queramos saber de los tubos muestra que más tardes queramos comparar con la recta: 

Resultados

Los resultados los tendremos en la siguiente práctica cuando hagamos la siembra de agua peptonada y midamos su absorbancia

Día 19 - Recontando coliformes fecales en medio Levine

Recuento de coliformes fecales en placa

 

Sesión 9                   Práctica 11

Seguimos concretando en la busca de nuestros microorganismos, al principio nos valían todos los mesófilos, luego nos fuimos a por coliformes totales y ahora un paso más buscando coliformes fecales, se va poniendo más interesante ¡A por la bata!

Objetivos

Realizar una siembra en placa por césped en medio Levine

Cultivarlo a 44ªC durante 24h

Recontar las colonias que se encuentren

Fundamento

El fundamento es determinar el número de coliformes que tenemos en la muestra usando una siembra a distintos volúmenes, es decir, realizar diluciones de esa muestra con agua destilada estéril para ir reduciendo la concentración de microorganismos. Luego cada dilución la introduciremos en el agar Levine para comprobar que tipo de colonias se forman y número de ellas.

Agar Levine

Medio adecuado para la búsqueda y diferenciación de bacilos entéricos, a partir de muestras clínicas, aguas servidas, y otros materiales. El Agar Levine o Agar EMB Levine es un medio de cultivo usado para el aislamiento y diferenciación de E.coli, tiene un aspecto purpúreo, aunque naranja tras su esterilización, es semisólido, y está destinado al cultivo en placa.

Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de color azulado-negro, con brillo metálico. Las colonias producidas por microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras. Algunas bacterias Gram positivas (cepas de estafilococos, enterococos) y levaduras, pueden crecer, originando colonias incoloras y puntiformes.

Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias

Composición:

-Peptona (Nutrientes, aminoácidos, péptidos para desarrollo de bacterias)

-Lactosa  (Hidratos de carbono para fermentadores)

-Agar   (Para darle la consistencia al medio)

-Eosina y Azul de metileno (inhibe el desarrollo de microorganismos Gram positivos y de bacterias Gram negativas fastidiosas)

-Fosfato dipotásico (Para dar fostatos)

Útil para:

Materiales

Medio Levine

Asa de siembra de Digralsky

Placas de petry

Alcohol

Mechero bunsen

Micropipeta de 1ml

Boquillas micropipeta esteriles

Vasos de precipitado

Pipeta estéril 10ml

 Agua destilada

 4 Tubos de ensayo

 Mechero

Gradilla

Procedimiento

 

1. Preparamos nuestro lugar de trabajo con los materiales y desde el principio usamos el mechero bunsen para crear las condiciones de esterilidad necesaria para un cultivo

2. Con los cuatro tubos puestos en la gradilla, los rellenamos con 9ml cada uno de agua destilada estéril que cogeremos con una pipeta también estéril, tener cuidado con no cometer errores porque la esterilidad de los materiales se va con facilidad

3. Seguidamente cogemos 1 ml de agua de muestra con la micropipeta y la echamos sobre el primer tubo, con la boquilla estéril. Al llegar al primer tubo tendremos ya la primera dilución seriada 1:10

4. Con otra boquilla estéril diferente, desechando la anterior, cogemos 1ml de la primera dilución y lo pasamos al segundo tubo donde ahora tendremos una dilución 1/100 y así respectivamente con el tubo 3(1/1000) y tubo 4(1/10.000)

5. Es importante cada vez que se pasa al siguiente tubo, con la micropipeta y la boquilla correspondiente a cada tubo, mezclar bien el tubo para que se haga homogénea la mezcla y que se haga bien la siguiente dilución

6. Seguidamente tendremos una placa preparada de medio Levine  en la que sembraremos 1ml de cada dilución. Importante rotular en cada una qué dilución se ha puesto para después comprobar el resultado. Si hemos sembrado del primer tubo en el medio, pondremos que es la 1/10

7. La siembra se hace con el asa de Digralsky, esparciendo por la placa el líquido de la dilución. Es importante flamear el asa en alcohol antes y después de usarla para seguir con las condiciones de esterilidad. 

8. La siembra se hace moviendo el asa en círculos, y girando la placa para que llegue a todas las zonas la dilución

9. Por último dejamos secar bien y metemos en la estufa a 44ºC y boca abajo

Medidas de prevención

Si estamos trabajando con el mechero y alcohol, tener cuidado con llevar los guantes y poder cometer errores

Cuando se flamea el asa de Digralsky cuidado cuando se pasa por el alcohol, para que cuando se flamee no caigan gotas en el papel filtrante y pueda provocar fuego

Cálculos

480(colonias) · 10(tubo 1/100)/ 1 (ml de siembra)= 4800 UFC/ml Salmonella

Las otras placas no se podían contar porque eran menos de 30 colonias y el tubo 1/10 no se podía contar porque había demasiadas colonias y poco claras

Resultados

Nos salieron 480 colonias en el tubo 1/10 de coliformes fecales
4800 UFC/ml coliformes fecales