Tinción de Gram
Sesión
4
Práctica 6
Vamos con esta práctica que es de las que más me han
gustado, porque encima de tener su parte de puro laboratorio haciendo la
tinción, luego viene comprobar los resultados en el microscopio, y ¡el
microscopio es todo un mundo! Es emocionante descubrir que puede ser lo que
estás observando, bien aquí contaré la tinción pero luego en el siguiente post
haré un resumen de cómo funciona el microscopio y que podemos observar ¡A por
la bata!
Objetivos
Hacer la tinción de una muestra para hallar que
microorganismos se encuentran presentes
Fundamento
Diferenciar mediante la tinción entre las paredes
celulares de las bacterias Gram negativa y Gram negativa. Mientras que la pared
celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa depeptidoglicano,
además de dos clases de ácidos teicoicos, la capa de peptidoglicano de las Gram
negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática
exterior (descomposición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas. Por
lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas
diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es
el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram
positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
Materiales
Cubeta de cristal
Puente de tinción
Mechero bunsen
Vaso de precipitado
Pipeta Pasteur x3
Asa de siembra
Portaobjetos
Agua destilada
Papel secante
Reactivos
Lugol
Acetona (30% acetona y 70% Etanol)
Safranina
Cristal violeta
Procedimiento
1. Primero se pone una cubeta y sobre el un puente de
tinción que es sobre lo que vamos a trabajar, siempre sobre un papel para
evitar posibles manchas en la mesa.
2. Cogemos un portaobjetos y en caso de ser un medio
espeso sobre el que vamos a hacer la tinción añadimos una gota de solución
salina estéril. En caso de ser ya un medio líquido podemos obviar este paso.
3. Tomamos una colonia de la muestra que vamos a
tintar y disgregamos por el centro del portaobjetos de forma que quede
delimitado en el centro pero bien extendido para evitar grumos o aglomeraciones
de células
4. Secamos el contenido del porta objetos bien al aire
o sobre la llama del mechero bunsen teniendo cuidado que no vayamos a quemar de
más la muestra, cuando se seque pasamos 4 o 5 veces otra vez la muestra para
fijar bien los microorganismos
5. Empezamos la primera tinción con el cristal violeta
durante un minuto para que se impregne lo suficiente del tinte, éste dará color
a las Gram positivas
6. Lavar con abundante agua corriente el exceso de
colorante, es importante lavar por lo menos durante 4 o 5 veces siempre
intentado quitar todo el exceso posible de tinte hasta que el porta objetos
tenga la zona con la muestra con un tenue color azulado .En nuestro caso usamos
agua del grifo porque sabemos que tiene un pH correcto, pero en caso de no
serlo usar agua con un pH neutro
7. Ahora añadiremos Lugol durante un minuto a la
muestra, actuara como una “laca” fijando bien el tinte a las células que lo
tengan
8. Lavar otra vez con agua en exceso para eliminar
bien, repetir durante tres o cuatro veces
9. Ahora procedemos a utilizar el Alcohol-Acetona 7:3,
verteremos gota a gota en el portaobjetos inclinado durante unos 40 segundos.
Es recomendado 1 minuto pero evita más errores quitarlo un poco antes.
10. Lavar con abundante agua en exceso otra vez, pero
en este caso especialmente para asegurarnos que se elimina todo el disolvente,
es importante este paso.
11. Por último añadiremos la Safranina, que es el
segundo colorante que usaremos o colorante de contraste para darle la tinción a
las bacterias Gram negativas. Lo haremos durante un minuto.
12. Lavar con
abundante agua en exceso
13. Dejaremos secar la preparación para poder ser
utilizada en el microscopio
14. Examinar la composición de la placa al
microscopio, pudiendo ir con el revolver de más lejano a cercano o rápidamente
con el objetivo 100X y aceite de inmersión
Medidas de prevención
Nunca utilizar acetona pura porque eliminaría
completamente la tinción
Usar guantes a la hora de realizar la tinción ya que
los indicadores son muy fuertes y tarda en eliminarse el color de la piel
Resultados
Presencia de diplobacilos en la muestra de color rojo
claro
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