Día 16 - Sembrando y recontando en Verde Brillante (Salmonella)

Recuento en placa de Salmonella

 

Sesión 6                   Práctica 8

Por fin después de tanto cultivo y tanta siembra empezamos a recontar a nuestros pequeños que han crecido, hoy empezamos a recontar Salmonella que fue cultivada en el medio Verde Brillante, ya que es muy selectivo de ella, vamos a recontar ¡A por la bata!

Objetivos

Realizar una siembra de césped en verde brillante

Cultivarlo a 37ºC durante 24h

Recontar las colonias que se encuentren

Fundamento

 

El verde brillante es un medio de enriquecimiento altamente selectivo para el aislamiento de Salmonella spp., excepto S. typhi y S. paratyphi, a partir de muestras clínicas, alimentos, y otros materiales de importancia sanitaria. No se recomienda para el aislamiento de Shigella spp.

Es de un valor excepcional cuando se investiga un gran número de muestras de heces o alimentos, por su alta capacidad de diferenciación de las colonias sospechosas.

Se compone de:

-Pluripeptona y extracto de levadura (constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales)

-La lactosa y la sacarosa (hidratos de carbono fermentables)

-Rojo fenol (indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay producción de ácido a partir de la fermentación de azúcares)

-Cloruro de sodio (balance osmótico)

-Verde brillante (actúa como agente selectivo)

Incubación: Incubar 24 horas a 35-37°C.

Útil para:

Escherichia coli ATCC 25922     //  Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento

Salmonella enteritidis ATCC 13076    //  Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo

Salmonella typhi               //                 Crecimiento inhibido

Salmonella typhimurium ATCC 14028   //   Rosas, blancas o transparentes sobre fondo rojo

Shigella flexneri. ATCC 12022                      //                      Crecimiento inhibido

Staphylococcus aureus ATCC 25923               //                        Crecimiento inhibido

Materiales

Medio Verde Brillante

Asa de siembra de Digralsky

Placas de petry

Alcohol

Mechero bunsen

Micropipeta de 1ml

Boquillas micropipeta esteriles

Vasos de precipitado

Pipeta estéril 10ml

 Agua destilada

 4 Tubos de ensayo

 Mechero

Gradilla

Procedimiento

1. Preparamos nuestro lugar de trabajo con los materiales y desde el principio usamos el mechero bunsen para crear las condiciones de esterilidad necesaria para un cultivo

2. Con los cuatro tubos puestos en la gradilla, los rellenamos con 9ml cada uno de agua destilada estéril que cogeremos con una pipeta también estéril, tener cuidado con no cometer errores porque la esterilidad de los materiales se va con facilidad

3. Seguidamente cogemos 1 ml de agua de muestra con la micropipeta y la echamos sobre el primer tubo, con la boquilla estéril. Al llegar al primer tubo tendremos ya la primera dilución seriada 1:10

4. Con otra boquilla estéril diferente, desechando la anterior, cogemos 1ml de la primera dilución y lo pasamos al segundo tubo donde ahora tendremos una dilución 1/100 y así respectivamente con el tubo 3(1/1000) y tubo 4(1/10.000)

5. Es importante cada vez que se pasa al siguiente tubo, con la micropipeta y la boquilla correspondiente a cada tubo, mezclar bien el tubo para que se haga homogénea la mezcla y que se haga bien la siguiente dilución

6. Seguidamente tendremos una placa preparada de medio Verde Brillante en la que sembraremos 1ml de cada dilución. Importante rotular en cada una qué dilución se ha puesto para después comprobar el resultado. Si hemos sembrado del primer tubo en el medio, pondremos que es la 1/10

7. La siembra se hace con el asa de Digralsky, esparciendo por la placa el líquido de la dilución. Es importante flamear el asa en alcohol antes y después de usarla para seguir con las condiciones de esterilidad. 

8. La siembra se hace moviendo el asa en círculos, y girando la placa para que llegue a todas las zonas la dilución

9. Por último dejamos secar bien y metemos en la estufa a 37ºC y boca abajo

Medidas de prevención

Si estamos trabajando con el mechero y alcohol, tener cuidado con llevar los guantes y poder cometer errores

Cuando se flamea el asa de Digralsky cuidado cuando se pasa por el alcohol, para que cuando se flamee no caigan gotas en el papel filtrante y pueda provocar fuego

Cálculos

264(colonias) · 10(tubo 1/10)/ 1 (ml de siembra)= 2640 UFC/ml Salmonella

Las otras placas no se podían contar porque eran menos de 30 colonias

Resultados

Nos salieron 264 colonias en el tubo 1/10 de Salmonella, y una colonia de E.Coli
2640 UFC/ml Salmonella