Día 19 - Recontando coliformes fecales en medio Levine

Recuento de coliformes fecales en placa

 

Sesión 9                   Práctica 11

Seguimos concretando en la busca de nuestros microorganismos, al principio nos valían todos los mesófilos, luego nos fuimos a por coliformes totales y ahora un paso más buscando coliformes fecales, se va poniendo más interesante ¡A por la bata!

Objetivos

Realizar una siembra en placa por césped en medio Levine

Cultivarlo a 44ªC durante 24h

Recontar las colonias que se encuentren

Fundamento

El fundamento es determinar el número de coliformes que tenemos en la muestra usando una siembra a distintos volúmenes, es decir, realizar diluciones de esa muestra con agua destilada estéril para ir reduciendo la concentración de microorganismos. Luego cada dilución la introduciremos en el agar Levine para comprobar que tipo de colonias se forman y número de ellas.

Agar Levine

Medio adecuado para la búsqueda y diferenciación de bacilos entéricos, a partir de muestras clínicas, aguas servidas, y otros materiales. El Agar Levine o Agar EMB Levine es un medio de cultivo usado para el aislamiento y diferenciación de E.coli, tiene un aspecto purpúreo, aunque naranja tras su esterilización, es semisólido, y está destinado al cultivo en placa.

Los microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de color azulado-negro, con brillo metálico. Las colonias producidas por microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras. Algunas bacterias Gram positivas (cepas de estafilococos, enterococos) y levaduras, pueden crecer, originando colonias incoloras y puntiformes.

Es un medio selectivo y diferencial, adecuado para el crecimiento de enterobacterias

Composición:

-Peptona (Nutrientes, aminoácidos, péptidos para desarrollo de bacterias)

-Lactosa  (Hidratos de carbono para fermentadores)

-Agar   (Para darle la consistencia al medio)

-Eosina y Azul de metileno (inhibe el desarrollo de microorganismos Gram positivos y de bacterias Gram negativas fastidiosas)

-Fosfato dipotásico (Para dar fostatos)

Útil para:

Materiales

Medio Levine

Asa de siembra de Digralsky

Placas de petry

Alcohol

Mechero bunsen

Micropipeta de 1ml

Boquillas micropipeta esteriles

Vasos de precipitado

Pipeta estéril 10ml

 Agua destilada

 4 Tubos de ensayo

 Mechero

Gradilla

Procedimiento

 

1. Preparamos nuestro lugar de trabajo con los materiales y desde el principio usamos el mechero bunsen para crear las condiciones de esterilidad necesaria para un cultivo

2. Con los cuatro tubos puestos en la gradilla, los rellenamos con 9ml cada uno de agua destilada estéril que cogeremos con una pipeta también estéril, tener cuidado con no cometer errores porque la esterilidad de los materiales se va con facilidad

3. Seguidamente cogemos 1 ml de agua de muestra con la micropipeta y la echamos sobre el primer tubo, con la boquilla estéril. Al llegar al primer tubo tendremos ya la primera dilución seriada 1:10

4. Con otra boquilla estéril diferente, desechando la anterior, cogemos 1ml de la primera dilución y lo pasamos al segundo tubo donde ahora tendremos una dilución 1/100 y así respectivamente con el tubo 3(1/1000) y tubo 4(1/10.000)

5. Es importante cada vez que se pasa al siguiente tubo, con la micropipeta y la boquilla correspondiente a cada tubo, mezclar bien el tubo para que se haga homogénea la mezcla y que se haga bien la siguiente dilución

6. Seguidamente tendremos una placa preparada de medio Levine  en la que sembraremos 1ml de cada dilución. Importante rotular en cada una qué dilución se ha puesto para después comprobar el resultado. Si hemos sembrado del primer tubo en el medio, pondremos que es la 1/10

7. La siembra se hace con el asa de Digralsky, esparciendo por la placa el líquido de la dilución. Es importante flamear el asa en alcohol antes y después de usarla para seguir con las condiciones de esterilidad. 

8. La siembra se hace moviendo el asa en círculos, y girando la placa para que llegue a todas las zonas la dilución

9. Por último dejamos secar bien y metemos en la estufa a 44ºC y boca abajo

Medidas de prevención

Si estamos trabajando con el mechero y alcohol, tener cuidado con llevar los guantes y poder cometer errores

Cuando se flamea el asa de Digralsky cuidado cuando se pasa por el alcohol, para que cuando se flamee no caigan gotas en el papel filtrante y pueda provocar fuego

Cálculos

480(colonias) · 10(tubo 1/100)/ 1 (ml de siembra)= 4800 UFC/ml Salmonella

Las otras placas no se podían contar porque eran menos de 30 colonias y el tubo 1/10 no se podía contar porque había demasiadas colonias y poco claras

Resultados

Nos salieron 480 colonias en el tubo 1/10 de coliformes fecales
4800 UFC/ml coliformes fecales