Medición absorbancia Escala de MacFarland
Sesión
10
Práctica 12
Recordáis cuando hicimos la escala de MacFarland, hace
ya bastantes post hicimos solo los tubos para dejarlos preparados, pues ahora
vamos a hacer lo que es la medición de estos tubos, porque como dije, vamos a
hacer con las absorbancias que obtengamos en el espectrofotómetro una nueva
recta de calibrado ¡A por la bata!
Objetivos
Medir la absorbancia de los tubos de MacFarland que
elijamos para que nos salga significativa
Realizar la recta de calibrado
Fundamento
Como referencia en suspensiones bacteriológicas para
saber que el número de bacterias por mililitro, o más bien en UFC según una
escala que va de 0.5 a 10. Estos estándares son creados al mezclar soluciones
de cloruro de bario al 1% con ácido sulfúrico al 1% en volúmenes específicos,
para asegurar la densidad correcta se puede controlar usando
espectrofotómetros.
Los estándares pueden ser visualmente comparados con
suspensiones de bacterias en salina estéril o en caldos. Si la suspensión es
demasiado turbia, puede añadirse diluyente, y si no es lo suficiente turbia, se
puede agregar más bacterias. La ventaja es que no es necesario incubar ni usar
equipo especial para estimar el número de bacterias
La espectrofotometría es uno de los métodos de
análisis más usados, y se basa en la relación que existe entre la absorción de
luz por parte de un compuesto y su concentración. Cuando se hace incidir luz
monocromática (de una sola longitud de onda) sobre un medio homogéneo, una
parte de la luz incidente es absorbida por el medio y otra transmitida, como
consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea atenuada desde Po a P, siendo
Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad del rayo de luz transmitido.
Dependiendo del compuesto y el tipo de absorción a
medir, la muestra puede estar en fase líquida, sólida o gaseosa. En las
regiones visibles y ultravioleta del espectro electromagnético, la muestra es
generalmente disuelta para formar una solución.
Cada sustancia
tiene su propio espectro de absorción, el cual es una curva que muestra la
cantidad de energía radiante absorbida, Absorbancia, por la sustancia en cada
longitud de onda del espectro electromagnético, es decir, a una determinada longitud
de onda de la energía radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de
radiación que es distinta a la que absorbe otro compuesto.
Materiales
Regla
Calculadora
Tubos de MacFarland (Anteriormente realizados)
Material para escribir
Agua destilada estéril
Aparato
Espectrofotómetro (Con sus cubetas)
Procedimiento
1. Montamos el lugar de trabajo donde el
espectrofotómetro, comenzaremos encendiéndolo ya que primero se tiene que
calibrar y eso le lleva algo de tiempo, mientras preparamos el resto de material
2. Una vez calibrado ponemos la absorbancia en 550nm y
dejamos puesta la celda del “blanco” en el espectrofotómetro ya que será ahí
donde hagamos todas las mediciones
3. Introducimos primero el tubo “blanco” con agua
destilada estéril, con el que vamos a tarar en autocero, así el resto de tubos
que introduzcamos serán con absorbancias correctas
4. De los tubos de la Escala de MacFarland elegimos
cuales queremos que sean los representativos para hacer nuestra recta de
calibrado, en nuestro caso tubos: 0(Blanco), 0.5, 3, 5 y 6
5. Al saber la absorbancia de cada uno de los tubos ya
sabemos la (Y) de nuestra recta de regresión, y el UFC ya lo sabíamos de cada
tubo que es la (X) por lo que podemos comenzar con nuestra recta de calibrado
haciendo la primera tabla:
6. Realizamos el coeficiente de regresión para ver si
la pendiente de la recta es fiable:
7. Y por último podemos realizar ya la recta de
calibrado, en nuestro caso en cálculos solo, pero que es suficiente para
después hallar los datos que queramos saber de los tubos muestra que más tardes
queramos comparar con la recta:
Resultados
Los resultados los tendremos en la siguiente práctica
cuando hagamos la siembra de agua peptonada y midamos su absorbancia
No hay comentarios:
Publicar un comentario